基金项目:裸腹鲟人工繁殖技术研究初报

基金项目: 农业财政专项“西北地区重点水域渔业资源与环境调查”; 伊犁哈萨克自治州科技计划项目“伊犁河珍稀濒危鱼类裸腹鲟人工繁育技术研究”.

祼腹鲟(Acipenser nudiventris)俗称青鳇鱼,是大体型鲟, 卵质好, 生产的鱼子酱价格高, 是一种具有极高生态价值和经济价值的古老物种,堪称“水中活化石”。祼腹鲟曾广泛分布于欧洲的黑海、亚速海和中亚的里海、咸海, 以及上述区域的一些河流中, 对维持栖息地水域的生态平衡具有重要价值 。裸腹鲟出产的鱼子酱品质好、价格高, 历来是欧洲名贵食材。受持续多年的过度捕捞及环境变迁和涉水工程等影响, 裸腹鲟很早就被世界自然保护联盟(International Union forConservation of Nature, IUCN)《濒危物种红色名录》(www.iucnredlist.org)列为极危(critically en-dangered, CR)物种, 也是《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录二保护物种。裸腹鲟在动物地理、古生态、鱼类系统和气候变化等许多方面具有重要的科学价值。同时, 裸腹鲟作为我国重要的原生鲟种质资源, 在水产养殖中具有巨大的市场开发潜力。但是, 在中国 8 种原生鲟鱼中, 除已宣布灭绝的长江白鲟(Psephurus gladius)外 , 只有伊犁河裸腹鲟尚未实现人工繁殖, 物种保护形势迫在眉睫。

裸腹鲟在 1933—1934 年期间由苏联从锡尔河中移植到当时的中苏跨境河流伊犁河-巴尔喀什湖水系, 16 年后形成较大的捕捞群体 。由于伊犁河上游我国新疆干支流存在适宜产卵场, 经常有成熟亲鱼由哈萨克斯坦上溯至我国新疆河段繁殖, 20 世纪 70 年代在我国伊犁河新疆段形成了稳定经济渔获, 年产量约 40 t 。20 世纪 90 年代,苏联解体前后, 哈萨克斯坦渔业管理秩序一度混乱 , 受水利工程、环境污染、酷捕乱捞等因素影响, 野生裸腹鲟在哈萨克斯坦伊犁河–巴尔喀什湖水系濒于绝迹。目前, 我国新疆伊犁河裸腹鲟种群数量极少, 偶有发现, 已无法形成捕捞产量。被新疆维吾尔自治区列为自治区级一级保护野生动物, 也被列为国家二级保护野生动物。多年来,新疆社会各界对裸腹鲟的物种保护工作一直较为关注。因此, 对野生裸腹鲟的抢救性保护工作也具有极高的社会公益价值。

裸腹鲟性成熟年龄较大, 世代间隔长, 在伊犁河流域, 野生裸腹鲟性成熟年龄雄体一般为6~9 龄; 雌体多为 12~14 龄 [6] 。根据近期渔业资源调查监测, 伊犁河干支流已经多年未发现性成熟野生裸腹鲟个体, 野外捕捞到活体裸腹鲟极为罕见且主要为低龄个体为主。野生幼鱼在人工养殖条件下达到性成熟所需养殖周期超长, 所耗费的饲养管理经济和时间成本巨大。此外, 因不适应养殖环境而引发的养殖死亡或者性腺发育迟滞等现象也时有发生。多年来, 人工繁殖和苗种驯养等伊犁河裸腹鲟物种保护关键技术尚未取得实质性突破。

本研究通过在伊犁河中国新疆段持续多年收集裸腹鲟野生个体, 在人工环境下进行养殖驯化,并对其性腺发育状况进行了持续多年的连续监测,在产前实施模拟野外环境温度变化调控, 实现了部分性成熟个体的雌雄同步性腺发育, 并在此基础上通过人工催产和活体采卵受精, 取得了人工繁殖成功, 亲鱼恢复良好。本文是对伊犁河极度濒危物种裸腹鲟人工繁殖及苗种培育技术研究的初次成功报告, 通过对此次人工繁殖技术参数的系统梳理, 以期为后续裸腹鲟的全人工繁殖及规模化繁育提供借鉴, 为伊犁河流域裸腹鲟渔业资源恢复和利用开发提供苗种及扩繁群体。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 裸腹鲟的外部形态特征 祼腹鲟成鱼外观形态见图 1, 背向观呈灰绿色, 体态类似长形纺锤, 体侧颜色较淡, 腹部一般呈现黄白色, 鳍色多为灰色。体被骨板行数为 5, 其中第 1 行是最大骨板, 与头顶斜面成钝角, 与其他鲟区别明显。体表骨板间没有小骨板, 其中骨板背面 11~17 枚,侧面 49~74 枚, 腹面 11~17 枚。吻平滑、稍圆, 几乎为一完整的圆锥形(图 2), 腹面口位, 较大且下唇中央不分离。有触须 4 根, 须长为头长 7.1%~17.6%; 鳃耙数为 24~45; 背鳍条不分支, 39~57 条;臀鳍条也不分支, 数目为 23~37。

图 1 裸腹鲟成体形态特征

图 2 裸腹鲟成鱼头部形态(腹面)

1.1.2 亲本来源及饲养管理 本研究所有个体均收集自伊犁河流域野生个体, 经研究团队自 2013年以来持续收集, 保存于新疆伊河鲟业科技有限公司与中国水产科学研究院黑龙江水产研究所联合设立的巩留科学实验基地流水池塘饲养管理,养殖池规格为直径 16 m、水深 2.5 m 的圆形流水水泥池, 采用伊犁河流域建设管理局恰莆其海水库底排水养殖, 养殖水体温度范围为 0~22 ℃。投喂天邦鲟鱼颗粒配合饲料, 日投喂量为 0.5%~1.0%。现保存野生裸腹鲟成年个体原种 13 尾, 作为人工繁殖的基础种群。利用微创手术、超声波和血液学指标动态综合检测成年个体性腺发育状况。

1.2 人工催产及孵化管理

2020 年 5 月采用微创手术法和 PI (polariza-tion index)指数法对亲鱼群体的性腺发育情况进行监测, 将性腺发育至IV期的裸腹鲟亲鱼转移至待产池内, 选择卵母细胞极化指数 PI<0.1 的雌性亲鱼与显微镜下含少量精子的雄性亲鱼进行人工催产开展人工繁殖实验。催产药物为 LHRH-A2(宁波第三药厂), 其中雌性亲鱼采用二针注射法,雄性亲鱼采用一针注法。雌性亲鱼第一针的注射剂量为 0.8~1.0 g/kg (体重), 10~12 h 后注射雌性亲鱼第二针和雄性亲鱼, 雌性亲鱼第二针的注射剂量为 2~3 g/kg (体重), 雄性亲鱼的注射剂量为雌性亲鱼注射总剂量的 1/2。催产温度 15~16 ℃。效应期后, 精液采用腹部按压法进行分批次活体采集, 充氧后于 2~4 ℃冰箱避光储存; 卵子采用腹部按压法与微创手术法一次性采集, 采用半干法人工授精, 授精前检测精液质量。

受精卵采用 15%~20%的滑石粉溶液脱黏45 min, 脱黏后置于瓶式孵化器(图 3), 孵化水温16.5~18.0 ℃、溶氧≥6.0 mg/L, 采用 RC-T601A智能便携式温度记录仪每隔 30 min 测定孵化水温。孵化期内在解剖镜下连续观察裸腹鲟胚胎发育全过程, 发育前期每 0.5 h 观察 1 次, 到达囊胚期后 1.5~3 h 观察 1 次, 并记录胚胎发育不同阶段的时间。仔鱼孵出后每天取 15观察其变化, 至开口摄食。

图 3 裸腹鲟受精卵瓶式孵化方式

1.3 鱼苗的人工驯养方法与日常管理

初孵裸腹鲟仔鱼采用半径为 0.6 m×0.5 m 深的圆形玻璃槽养殖, 具有集群现象(图 4)。养殖水温为17~18 ℃, 养殖7~8 d后, 开始肠道排栓, 投喂水蚯蚓段(水蚯蚓采用打浆机打碎成段), 日投喂 6~8 次, 投喂量为体重的 20%。投喂 2 周后, 采用水蚯蚓段加人工颗粒配合粉料(粉料为北欧玛公司进口仔鱼开口料), 开始人工颗粒饲料驯养,驯养期为 30~40 d, 日投喂次数为 6 次, 投喂量为体重的 10%。每次投喂时间为 20~30 min, 每次投喂后及时清除残饵与粪便。

温为17~18 ℃, 养殖7~8 d后, 开始肠道排栓, 投喂水蚯蚓段(水蚯蚓采用打浆机打碎成段), 日投喂 6~8 次, 投喂量为体重的 20%。投喂 2 周后, 采用水蚯蚓段加人工颗粒配合粉料(粉料为北欧玛公司进口仔鱼开口料), 开始人工颗粒饲料驯养,驯养期为 30~40 d, 日投喂次数为 6 次, 投喂量为体重的 10%。每次投喂时间为 20~30 min, 每次投喂后及时清除残饵与粪便。

图 4 裸腹鲟初孵仔鱼的集群现象

1.4 测定方法

卵径、卵子质量、精液质量等指标测定参考刘鉴毅等 。其中, 卵径测量以长径和卵子质量计算, 按卵子排出的前中后期抽取 3 次, 每次随机抽取 50 粒卵, 测量其长径和质量; 采用体积法估算产卵量; 胚胎发育至期后统计其受精率,每批次抽取 200 颗胚胎计算受精率。孵化期内在解剖镜下观察裸腹鲟子代的胚胎发育全过程, 发育前期每 0.5 h 观察 1 次, 囊胚期后 1.5~3 h 观察1 次。

2 结果与分析

2.1 人工养殖条件下裸腹鲟性腺发育情况鉴定

驯养裸腹鲟成体共计 13 尾, 年龄 12~16 龄,经鉴定确认 5 尾雌鱼, 7 尾雄鱼, 1 尾无法辨识。2019年9月鉴定, 有2尾雌鱼性腺发育已达IV期,平均体重 32.65 kg。性腺发育进入 III 期的鲟摄食状况未有明显改变, 而进入IV期后的亲鱼摄食明显减弱(表 1)。催产前 2~3 个月, 将性腺发育至 IV期的雌性亲鲟转入生态调控池中, 通过腹部微创法采集卵子后计算 PI 值, 入池时 PI 指数约为 0.02,PI 指数达到 0.1 左右, 转入室内待产。精巢发育至IV末期的雄性亲鱼于产前1个月转移至生态调控池中直至完全性腺成熟, 轻压腹部有大量精液溢出。

表 1 性腺发育 IV 期的裸腹鲟生物学指标

2.2 裸腹鲟的繁殖性能及人工催产繁殖效果分析

经性腺发育同步生态调控后共计有 2 尾雌鱼和 3 尾雄鱼实现了性腺同步成熟, 进行了人工催产繁殖。雌性亲鲟在 LHRH-A2 注射第二针后的15~18 h 开始排卵, 采用腹部按压法与微创手术法一次性收集卵子。雌性亲鲟产前平均体重 35.65 kg,产卵后平均体重下降至约 30 kg, 腹腔内有部分鱼卵, 后续会逐渐排空。2 尾雌鱼共计产卵量 21.1万粒(分别为 5.5 万粒、15.6 万粒), 卵径分布范围为 2.95~3.44 mm, 平均卵径(3.21±0.25) mm, 平均质量(0.042±0.011) g, 产卵总质量 5.04 kg,约占体重的 14.2%。雄鱼在 LHRH-A2 注射 10 h后分 5 批次采集精液, 合计采精量 2 850 mL。雄鲟产前平均体重 27.35 kg, 产后平均体重 20 kg。所采集的精子剧烈运动时间平均达(46.12±6.47) s,平均寿命为(260.18±55.62) s, 平均受精率 55%,孵化率 42.5% (表 2)。

表 2 裸腹鲟繁殖性能及人工催产效果

2.3 胚胎发育和出苗仔鱼观察

观察伊犁河裸腹鲟子一代胚胎各发育阶段并计算发育积温。最初判断受精率可以在第二次卵裂开始, 受精后 3.5 h发育至 4细胞期, 12.5 h到达囊胚期, 26 h 到达原肠中期, 48 h 神经管闭合, 62 h心脏搏动期, 83 h 尾部心脏, 130 h 左右大量出苗(表 3)。孵化水温 16.5~18.0 ℃时, 裸腹鲟从受精至孵化出膜需 123~145 h, 总积温为 2030~2755 ℃·h。获初孵仔鱼约 25200 尾顺利开口摄食,初孵仔鱼体长 9.56~11.96 mm。

表 3 伊犁河裸腹鲟子一代胚胎各发育阶段积温

3 讨论

3.1 中国鲟种质资源保护与利用现状

历史上, 中国天然水域鲟渔业资源较为丰富,共分布有 8 种鲟, 隶属于 2 科、3 属, 包括鲟科鲟属的中华鲟(Acipenser sinensis)、达氏鲟(Acipenserdabryanus)、西伯利亚鲟(Acipenser baerii)、小体鲟(Acipenser ruthenus)、裸腹鲟和施氏鲟(Acipenser schrenkii), 鲟科鳇属的达氏鳇(Husodauricus)和白鲟科白鲟属的长江白鲟 。其中,长江流域 3均被列为国家一级保护野生动物,其他 5 种鲟均为国家二级保护野生动物。中国水产工作者在 21 世纪初期, 陆续突破了施氏鲟 、西伯利亚鲟 、中华鲟 等鲟的全人工繁殖技术。通过原地保护、迁地保护及原栖息地增殖等策略方法, 除长江白鲟外, 我国大部分鲟鱼物种避免了物种意义上的灭绝。但是, 野生鲟资源量在近年来仍呈现急剧。为减少因鲟消费对野生鲟资源的破坏, 全球现存所有种类野生鲟已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录二保护物种 。伊犁河流域裸腹鲟自 20 世纪 90 年代以来近 30 年来没有突破人工繁殖技术, 伊犁河–巴尔喀什湖水系野生鲟已经近乎完全绝迹, 通过十余年努力, 本研究团队共收集到 13 尾大个体野生裸腹鲟, 在人工养殖环境下驯养。截至目前, 国内仅有黑龙江水产研究所巩留科学实验基地保存有 5活体河裸腹鲟发育至性成熟, 这为本次人工繁实验的开展提供了亲本材料。

3.2 裸腹鲟亲鱼适宜养殖条件和营养需求

水温变化、光周期及饲料营养等因子是鲟类性腺发育及成熟的主要影响因素, 在诱导和启动鱼类内分泌系统“下丘脑–垂体–性腺轴”过程中起到重要作用 。一般说来, 常规池塘养殖环境往往不利于野生鲟幼体启动与性腺发育相关的生殖内分泌调节途径 , 本研究依托的科学实验基地位于伊犁哈萨克自治州巩留县伊犁河谷, 伊犁河与里海处于同一纬度, 气候也比较相似。在此进行裸腹鲟的物种保护与驯养繁育具有得天独厚的水源、地理、气候、环境优势。在饲料营养方面, 本研究采用投喂配合饲料方式能够使部分裸腹鲟性腺发育达到最终成熟。也有研究表明, 添加鲜活鱼或冰鲜鱼更有利于鲟性腺发育启动 , 可能是由于鲜活或冰鲜鱼类或虾类的营养物质在体内具有更高的吸收转化效率, 更有利于雌鱼卵黄营养物质的积累, 进而更有利于性腺发育。

3.3 人工驯养条件下裸腹鲟的人工繁殖

伊犁河水系的裸腹鲟最初来源于咸海水系的锡尔河, 咸海水系裸腹鲟种群几乎濒于绝迹。据历史文献记载, 在咸海, 裸腹鲟鱼卵平均卵径为1.55~3 mm, 平均卵质量为 0.0114 g 。本研究中获得的伊犁河裸腹鲟鱼卵卵径分布范围为 2.95~3.44 mm, 平均卵径3.21 mm, 平均质量0.042 g。卵质量和规格均明显好于咸海水系野生裸腹鲟,推测原因可能是个体在池塘饲养环境下, 亲鱼可以获得更好饲料营养条件, 节约安全防卫、繁殖求偶等行为消耗能量, 从而改善繁殖性能。裸腹鲟作为鲟中的较大型个体, 同样不具有副性征, 繁殖期外观难以分辨雌雄, 其雌性个体的怀卵数量多于西伯利亚鲟、俄罗斯鲟以及施氏鲟等个体。鲟雌鱼卵巢发育的成熟度受营养状况、养殖温度等环境条件影响, 而鲟卵子的终末成熟则受低温期的影响。由于受人工养殖环境条件的影响, 且裸腹鲟雌性个体的卵巢较大, 重达体重的 12%~15%, 同一条亲鱼卵巢中卵子的发育成熟度不同步。因此，在繁殖生产过程中, 精准判断卵子成熟度对提高裸腹鲟的受精率尤为重要, 本研究中采用 PI 指数法判断卵子的成熟度并综合雌鱼繁殖后期的腹部特征确保了本次人工繁殖的成功。同时, 由于缺乏裸腹鲟的繁殖特性数据、收集到的个体数量有限且捕捞时个体发育状况具有随机性, 本次研究中裸腹鲟人工繁殖技术参数也很难实现如中华鲟、施氏鲟、达氏鳇等各级年龄梯队组合的养殖鲟群体可以实施多次重复对比优化 , 这也是此次裸腹鲟人工繁殖孵化率和苗种成活率较低的原因之一。另外, 需要引起注意的是, 目前保存的伊犁河裸腹鲟能繁亲鱼数量过少, 交配选择余地有限, 可能会导致与配亲本遗传背景单一, 因近交降低繁殖效率。因此, 裸腹鲟人工繁殖群体应注意利用综合分子标记及系谱档案等多样化的育种信息做好亲本及扩繁群体的遗传管理。

根据本研究团队多年积累经验, 繁殖期低温刺激是调控鲟尤其是野生鲟性腺发育成熟的关键措施之一。本研究通过对产前亲本模拟自然生态环境降温刺激调控, 实现雌雄同步成熟, 进而取得了伊犁河裸腹鲟首次人工繁殖成功, 并且产后雌雄亲本均迅速恢复体能, 产后一周左右即已恢复进食, 各项身体指标均显示健康状况良好。

3.4 裸腹鲟胚胎发育及苗种培育

裸腹鲟胚胎发育与其他鲟鱼类似, 大致可以划分为受精, 卵裂和囊胚, 原肠胚, 原肠胚结束到心跳开始, 心跳开始到孵出鱼苗等 5 个发育阶段 。只是受物种特性和水温条件等因素影响,与其他鲟胚胎发育各阶段的积温有所不同。近年来, 极危物种裸腹鲟在全球范围内都很难寻觅野生个体, 可以用于直接比较的结果不多。伊朗学者 2014 年发表文献表示他们采用外源激素诱导性腺同步发育, 实现了里海野生裸腹鲟人工繁殖,受精率最高可达 96%, 孵化得到 11.5 万尾初孵仔鱼, 开口饵料是水蚤和卤虫无节幼体 ; 但该文

献对苗种培育成活率和苗种规格等信息没有进一步交代, 无法进一步比较。伊朗研究者保有较大规模的养殖群体, 挑选出 6 雌 6 雄共 12 尾性腺发育成熟的亲鱼参与实验。本研究中基础群体只有13 尾, 性腺发育至 IV 期的亲鱼只有 5 尾, 为降低对亲鱼伤害, 只采用了水温调节等非药物方法进行生态调控性腺同步发育。伊朗实验使用外源激素诱导, 雌雄性腺发育的同步性程度更高, 因此获得了更高的受精率。开口饵料方面, 本研究参考主要养殖鲟苗种培育方法 , 以水蚯蚓作为开口饵料, 也可以顺利使子一代裸腹鲟苗开口摄食,并通过调整人工饲料和水蚯蚓比例也能实现鱼苗转口摄食人工配合饲料。水蚯蚓在成本和易得性方面比水蚤和卤虫无节幼体更有优势。

此外, 由于此次“新冠疫情”突然暴发正值裸腹鲟成熟待产期间, 新疆、黑龙江等省区人员和物资流通多有不便, 导致一些专业技术人员、实验仪器设备、药品耗材甚至生物饵料等不能及时抵达裸腹鲟人工繁殖和苗种培育实验现场。尽管如此, 本次实验仍克服了诸多困难, 经多方努力创造条件, 最终取得了首次伊犁河裸腹鲟人工繁殖成功。但是, 本年度实验现场条件相对简陋, 条件尚有欠缺, 使得很多实验过程数据标准化程度不够, 例如裸腹鲟胚胎发育各阶段只能在解剖镜下观察, 没能获得清晰的胚胎发育照片。在今后的研究中, 将针对伊犁河裸腹鲟的繁殖生物学特点进一步优化人工繁殖各项技术参数, 对现有研

究结果的不足之处逐步补充完善。同时, 本研究亲本群体数量少, 现阶段主要以保存亲鱼群体安全, 实现人工繁殖, 获得活体后代为目的, 实验手段相对比较保守。没有尝试采用更多的技术手段, 例如外源激素诱导、光周期调控等其他性腺发育调节方法。随着储备群体逐步扩大, 未来我们将进一步优化完善伊犁河裸腹鲟人工繁殖技术体系流程, 并最终实现全人工繁殖。届时, 通过野生裸腹鲟子一代苗种反哺伊犁河水系野生群体,保护珍稀濒危物种, 恢复水域渔业资源将成为可能。